Phytomedicine | 湖北中醫(yī)藥大學(xué)團(tuán)隊(duì)揭示大黃甘草湯通過SIRT3介導(dǎo)NRF2去乙酰化抑制急性腎損傷中鐵死亡

摘要

背景：急性腎損傷（AKI）是膿毒癥的主要并發(fā)癥，亟需探索新的治療方式。中藥大黃甘草湯（DHGC）在治療膿毒癥相關(guān)急性腎損傷（SA-AKI）方面具有潛力，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

目的：本研究旨在驗(yàn)證大黃甘草湯在體內(nèi)外治療膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中抑制鐵死亡的作用。

方法：采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo) C57BL/6 小鼠和 C57BL/6 背景的沉默信息調(diào)節(jié)因子 3（SIRT3）敲除（SIRT3?/?）小鼠，使用 erastin 誘導(dǎo)正常和 SIRT3 小干擾 RNA（si-SIRT3）轉(zhuǎn)染的人近端腎小管上皮（HK-2）細(xì)胞建立鐵死亡模型，隨后進(jìn)行大黃甘草湯處理。首先，通過液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）鑒定大黃甘草湯的成分，并通過與高效液相色譜（HPLC）參考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比進(jìn)一步篩選潛在活性成分。采用生化檢測(cè)、透射電子顯微鏡（TEM）、免疫組織化學(xué)、免疫熒光和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 - 8（CCK-8）檢測(cè)等方法，評(píng)估體內(nèi)外鐵死亡水平及大黃甘草湯的保護(hù)機(jī)制。通過 RNA 測(cè)序（RNA-seq）鑒定關(guān)鍵通路，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）驗(yàn)證。最后，將潛在活性成分與 SIRT3 進(jìn)行分子對(duì)接，篩選候選單體用于后續(xù)體外功能驗(yàn)證。

結(jié)果：脂多糖成功誘導(dǎo)小鼠膿毒癥相關(guān)急性腎損傷，erastin 成功誘導(dǎo) HK-2 細(xì)胞鐵死亡。大黃甘草湯可改善腎功能、提高細(xì)胞活力，并逆轉(zhuǎn)鐵死亡關(guān)鍵指標(biāo)的異常變化。機(jī)制上，建模后 SIRT3 / 核因子紅細(xì)胞 2 相關(guān)因子 2（NRF2）通路相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，NRF2 核轉(zhuǎn)位受抑；而大黃甘草湯可上調(diào) SIRT3/NRF2 通路相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn) NRF2 核轉(zhuǎn)位，激活下游谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）表達(dá)。重要的是，在 SIRT3 缺陷模型中，大黃甘草湯無法改善上述指標(biāo)。通過 HPLC 參考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比篩選出大黃甘草湯的潛在活性成分，經(jīng)與 SIRT3 分子對(duì)接鑒定出候選單體，這些單體具有與大黃甘草湯一致的鐵死亡抑制作用。

結(jié)論：本研究首次證實(shí)，大黃甘草湯通過激活 SIRT3 介導(dǎo)的 NRF2 去乙酰化，促進(jìn) NRF2 核轉(zhuǎn)位，抑制鐵死亡，從而延緩膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)表明大黃甘草湯是治療膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的潛在候選藥物，值得進(jìn)一步臨床研究。

圖1.與 HPLC 參考標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)比。（A）大黃甘草湯提取物在 LC-MS/MS 分析中的負(fù)離子模式；（B）大黃甘草湯提取物在 LC-MS/MS 分析中的正離子模式。

圖2.膿毒癥相關(guān)急性腎損傷模型的建立。（A）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案示意圖；（B）血清尿素氮（BUN）水平指示的腎功能評(píng)估；（C）血清肌酐（SCr）水平；（D-F）血清炎癥細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、白細(xì)胞介素 - 6（IL-6）、白細(xì)胞介素 - 1β（IL-1β））的定量分析；（G）腎組織中鐵離子（Fe2?）含量的測(cè)定；（H-J）氧化應(yīng)激標(biāo)志物（血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）水平、谷胱甘肽（GSH）水平）的評(píng)估；（K）腎小管損傷評(píng)分的定量分析；（L）腎臟病理變化的代表性圖像，通過 H&E 染色評(píng)估腎臟組織學(xué)（×400，比例尺 = 50μm），免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) GPX4 和 4 - 羥基壬烯醛（4-HNE）表達(dá)（×400，比例尺 = 50μm），透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)（×12000，比例尺 = 1.0μm）。

圖3.體外鐵死亡模型的建立。（A-D）不同濃度和時(shí)長(zhǎng) erastin 處理的 HK-2 細(xì)胞經(jīng) CCK-8 assay 檢測(cè)的細(xì)胞活力；（E）Fer-1 對(duì)細(xì)胞活力的影響；（F-H）細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物（GSH 和 MDA）的定量分析；（I-K）細(xì)胞內(nèi)鐵水平（Fe2?、Fe3?和總鐵）的測(cè)定；（L）熒光強(qiáng)度指示的細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平代表性圖像（×200，比例尺 = 50μm）；（M-N）脂質(zhì)過氧化（C11-BODIPY）和亞鐵離子（FerroOrange）的代表性熒光圖像（×400，比例尺 = 20μm）。

圖4.大黃甘草湯逆轉(zhuǎn)膿毒癥相關(guān)急性腎損傷小鼠腎組織中的腎損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和鐵死亡。（A）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間線；（B-C）大黃甘草湯對(duì)腎功能標(biāo)志物（BUN 和 SCr）的影響（n=6）；（D-F）大黃甘草湯對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物（MDA、GSH 和 SOD）的影響（n=6）；（G）腎組織 Fe2?含量分析（n=6）；（H）腎臟病理和鐵死亡標(biāo)志物的代表性圖像，H&E 染色顯示組織學(xué)結(jié)構(gòu)（×400，比例尺 = 50μm），免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) GPX4 和 4-HNE（×400，比例尺 = 50μm），透射電子顯微鏡顯示線粒體超微結(jié)構(gòu)（×12000、×400，比例尺 = 1.0μm）；（I）差異表達(dá) mRNA 的火山圖（紅色：上調(diào)；藍(lán)色：下調(diào)）；（J）主成分分析（PCA）圖顯示各組間的明顯聚類；（K）差異表達(dá)基因的熱圖；（L-N）腎組織中 SIRT3、GPX4、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶 A 合成酶 4（ACSL4）、核 NRF2 和乙酰化 NRF2（ac-NRF2）表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析和定量（β- 肌動(dòng)蛋白（β-actin）和層粘連蛋白 B1（Lamin B1）作為內(nèi)參）（n=3）。

圖5.大黃甘草湯可恢復(fù) HK-2 細(xì)胞活力并減輕氧化應(yīng)激和鐵死亡。（A）不同大黃甘草湯濃度下 CCK-8 assay 檢測(cè)的細(xì)胞活力；（B-D）SOD、MDA 和 GSH 水平；（E-G）細(xì)胞內(nèi)鐵水平（Fe2?、Fe3?和總鐵）；（H-K）脂質(zhì)過氧化（C11-BODIPY）和亞鐵離子積累（FerroOrange）的代表性熒光圖像（×400，比例尺 = 20μm）；（L-N）SIRT3、GPX4、ACSL4、核 NRF2 和 ac-NRF2 的蛋白質(zhì)印跡分析和定量密度測(cè)定。

圖6.在 SIRT3?/?小鼠中，大黃甘草湯無法通過去乙酰化改善理化指標(biāo)或鐵死亡。（A-B）腎功能參數(shù)（BUN 和 SCr）（n=6）；（C-E）血清炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6 和 IL-1β）（n=6）；（F）腎小管損傷評(píng)分定量（n=6）；（G）H&E 染色、GPX4/4-HNE 免疫組織化學(xué)（×400，比例尺 = 50μm）和透射電子顯微鏡線粒體觀察（×12000，比例尺 = 1.0μm）的代表性圖像；（H-J）氧化應(yīng)激標(biāo)志物（SOD、GSH 和 MDA）（n=6）；（K）腎組織 Fe2?含量（n=6）；（L-N）SIRT3/NRF2 通路相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析（n=3）。

圖7.在 SIRT3 敲低的 HK-2 細(xì)胞中，大黃甘草湯無法通過 SIRT3 介導(dǎo)的 NRF2 去乙酰化減輕鐵死亡。（A）細(xì)胞活力（CCK-8 assay）；（B-D）細(xì)胞內(nèi) GSH、MDA 和 SOD 水平；（E-G）鐵代謝指標(biāo)（Fe2?、Fe3?和總鐵）；（H）C11-BODIPY 染色檢測(cè)脂質(zhì)過氧化的代表性熒光圖像（×400，比例尺 = 20μm）；（I-K）通路蛋白的蛋白質(zhì)印跡定量；（L）評(píng)估 NRF2 核轉(zhuǎn)位的代表性共聚焦顯微鏡圖像（×600，比例尺 = 10μm）；（M）大黃酸與 SIRT3 的分子對(duì)接可視化；（N-R）大黃酸單體對(duì)細(xì)胞活力和鐵死亡標(biāo)志物的影響。

圖8.大黃甘草湯通過 SIRT3/NRF2 通路改善膿毒癥相關(guān)急性腎損傷鐵死亡的示意圖。

結(jié)論

本研究結(jié)果表明，大黃甘草湯通過激活 SIRT3 介導(dǎo)的 NRF2 去乙酰化，促進(jìn) NRF2 核轉(zhuǎn)位，從而減輕鐵死亡。這些發(fā)現(xiàn)提示 SIRT3/NRF2 通路是膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的潛在治療靶點(diǎn)，并提供了支持大黃甘草湯在此背景下治療潛力的臨床前數(shù)據(jù)。

DOI: 10.1016/j.phymed.2025.157724

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