中科院1區(qū)（8.3）-天麻素通過(guò)Keap1/Nrf2信號(hào)通路抑制肝鐵死亡改善非酒精性脂肪肝病

【寫(xiě)在前面】：本期推薦的是由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染病科、 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)、貴州醫(yī)科大學(xué)等研究團(tuán)隊(duì)合作近期發(fā)表于Phytomedicine(IF8.3）的一篇文章，揭示天麻素通過(guò)Keap1/Nrf2信號(hào)通路抑制肝鐵死亡改善非酒精性脂肪肝病。

【期刊簡(jiǎn)介】

【題目及作者信息】

Gastrodin ameliorates nonalcoholic fatty liver disease via inhibiting hepatic ferroptosis by the Keap1/Nrf2 signaling pathway

背景

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一個(gè)全球性的健康挑戰(zhàn)，目前缺乏有效的治療方法。天麻素（GAS）是從天麻（蘭科）中提取的一種主要酚苷類化合物，具有多種有益特性，但其通過(guò)鐵死亡途徑在NAFLD中的潛在作用尚不清楚。

目的

研究GAS對(duì)NAFLD的治療效果，并闡明其潛在的分子機(jī)制。

方法

我們使用高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的小鼠以及用棕櫚酸（PA）和油酸（OA）處理的HepG2細(xì)胞建立了NAFLD模型。通過(guò)組織病理學(xué)和生化分析評(píng)估治療效果。采用免疫共沉淀（Co-IP）、藥物親和響應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性（DARTS）、細(xì)胞熱位移分析（CETSA）和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等技術(shù)研究分子機(jī)制和藥物靶點(diǎn)。

結(jié)果

GAS治療顯著減輕了肝臟炎癥和脂質(zhì)積聚，從而改善了代謝參數(shù)。此外，GAS減少了鐵過(guò)載和氧化應(yīng)激標(biāo)志物，恢復(fù)了抗氧化防御能力，并保護(hù)了線粒體功能。機(jī)制研究表明，相互作用實(shí)驗(yàn)揭示GAS直接結(jié)合Keap1，破壞Keap1/Nrf2復(fù)合物，促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，并增強(qiáng)下游靶基因FSP1和GPX4的表達(dá)。

結(jié)論

GAS通過(guò)直接靶向Keap1/Nrf2信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞鐵死亡，顯示出作為NAFLD治療藥物的顯著潛力。

圖文摘要

【前言】

非酒精性脂肪性肝病是一種普遍的慢性肝臟疾病，目前影響著全球約三分之一的人口。高脂高果糖飲食攝入和接觸毒素等飲食習(xí)慣是脂肪肝發(fā)生的關(guān)鍵因素。該疾病以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度積聚為特征，已成為慢性肝病的主要原因。隨著病情進(jìn)展，它可能發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌。目前它被歸類為一種多因素代謝性疾病，且尚無(wú)特異性治療方法。人們普遍認(rèn)為，其發(fā)病機(jī)制涉及肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常積聚、肝臟脂毒性、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化和促炎因子。該疾病的特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚以及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)失調(diào)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化和線粒體功能障礙是細(xì)胞死亡的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激會(huì)引發(fā)隨后的肝臟損傷和肝細(xì)胞死亡，在該疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。除了細(xì)胞凋亡和壞死，其他類型的細(xì)胞死亡也可能與其相關(guān)的肝毒性有關(guān)。

鐵死亡是一種鐵依賴性的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，其特征是鐵驅(qū)動(dòng)的多不飽和脂肪酸過(guò)氧化，導(dǎo)致活性氧積累和隨后的細(xì)胞死亡。肝臟中的鐵沉積與該疾病的各種組織病理學(xué)特征相關(guān)，相當(dāng)比例的患者表現(xiàn)出肝臟鐵過(guò)載，這會(huì)加重脂肪性肝炎。過(guò)度的鐵積聚可能增加肝細(xì)胞氣球樣變、炎性浸潤(rùn)和纖維化進(jìn)展，從而推動(dòng)疾病向更嚴(yán)重的階段發(fā)展。研究表明，鐵死亡抑制劑可以減輕特定飲食誘導(dǎo)的脂肪性肝炎中的脂肪變性和炎癥。與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4一起，鐵死亡抑制蛋白1作為一種抗氧化調(diào)節(jié)劑，用于清除脂質(zhì)過(guò)氧自由基并防止鐵死亡。鐵死亡抑制蛋白1是一種氧化還原酶，通過(guò)將輔酶Q10還原為泛醇來(lái)抑制鐵死亡，泛醇是一種親脂性自由基捕獲抗氧化劑，可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)通路的主要轉(zhuǎn)錄因子。在沒(méi)有外源應(yīng)激的情況下，Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白-1與該因子相互作用，促進(jìn)其泛素化和蛋白酶體降解。當(dāng)該關(guān)聯(lián)蛋白被修飾或與其他分子結(jié)合時(shí)，該因子與其分離，隨后得以穩(wěn)定、積累并發(fā)生核轉(zhuǎn)位。該因子靶向鐵死亡抑制蛋白1的啟動(dòng)子區(qū)域并影響其轉(zhuǎn)錄活性。研究表明，鐵死亡抑制蛋白1可調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的鐵死亡。

天麻素是天麻根莖中的一種主要酚苷，具有抗凋亡、抗炎和抗氧化特性，并能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。在藥物或化學(xué)物誘導(dǎo)的肝損傷動(dòng)物模型中，該成分抑制了炎癥和氧化應(yīng)激，并調(diào)節(jié)了腸道菌群組成。研究表明，該成分可以通過(guò)激活高脂高膽固醇飲食喂養(yǎng)小鼠體內(nèi)的特定通路來(lái)改善脂肪肝。此外，該成分在接受高膽固醇飲食的模式生物中表現(xiàn)出抗氧化活性和降脂作用。然而，該成分對(duì)脂肪肝中肝細(xì)胞鐵死亡以及疾病向更嚴(yán)重階段進(jìn)展的影響尚不清楚。該成分是一種潛在的鐵死亡抑制劑。在藥物誘導(dǎo)的腎毒性中，它通過(guò)介導(dǎo)特定信號(hào)軸抑制了腎小管上皮細(xì)胞的鐵死亡。另一項(xiàng)研究中，它通過(guò)減少神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細(xì)胞凋亡或氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞免受鐵死亡的影響。目前尚無(wú)關(guān)于該成分是否能抑制肝細(xì)胞鐵死亡并改善脂肪肝的報(bào)道。近期研究表明，該成分可激活特定通路并促進(jìn)關(guān)鍵因子的表達(dá)。然而，該成分是否通過(guò)該關(guān)鍵因子影響鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)尚未得到研究。

本研究證明，該成分通過(guò)抑制鐵死亡來(lái)減輕肝損傷并減少肝臟脂質(zhì)積聚。從機(jī)制上講，它促進(jìn)關(guān)鍵因子核轉(zhuǎn)位并增加下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制肝細(xì)胞鐵死亡并改善脂肪肝。這些發(fā)現(xiàn)表明，該成分是治療該疾病的一個(gè)有前景的候選藥物。

【結(jié)果部分】

1.天麻素改善了高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和炎癥。

圖1. 天麻素（GAS）改善了高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和炎癥。(A) GAS的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。(B) 實(shí)驗(yàn)時(shí)間線示意圖。(C) 代表性肝臟外觀照片及蘇木精-伊紅（H&E）染色圖（比例尺：5 mm和40 μm）。(D) 肝臟重量及肝體比。(E) 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平。(F) 肝臟切片中CD68免疫熒光染色圖（比例尺：50 μm）。(G) 肝臟組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-18（IL-18）的mRNA表達(dá)水平。

2.天麻素在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均減輕了肝臟脂肪變性。

圖2. 天麻素（GAS）減輕了高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性。(A)肝臟切片代表性油紅O染色圖（比例尺：40 μm）。(B) 血清甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平。(C) 肝臟組織中TG和TC含量。(D) 肝臟組織中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（Srebp-1c）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1a（Cpt1a）、酰基輔酶A氧化酶1（Acox1）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（Ppara）及脂肪酸合酶（Fasn）的mRNA表達(dá)水平。(E) 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)SREBP-1C、CPT1A、ACOX1、PPAR-α及脂肪酸合酶（FAS）的蛋白表達(dá)水平。(F) 肝臟組織中PPARα免疫熒光染色圖。(G) 葡萄糖耐量試驗(yàn)（GTT）結(jié)果。(H) 血漿葡萄糖水平。

3.天麻素在體內(nèi)外均能抑制鐵死亡。

圖3. 天麻素（GAS）在體內(nèi)外抑制鐵死亡。(A)差異表達(dá)基因火山圖（天麻素處理組，GAS vs. 高脂飲食處理組，M）。(B) 差異基因的KEGG富集分析。(C) 肝臟丙二醛（MDA）水平。(D) 肝臟谷胱甘肽（GSH）水平。(E) HepG2細(xì)胞中BODIPY 581/591 C11熒光（脂質(zhì)過(guò)氧化）染色（比例尺：20 μm）。(F) HepG2細(xì)胞中JC-1染色（線粒體膜電位）（比例尺：20 μm）。(G) HepG2細(xì)胞中DHE（二氫乙啶，活性氧）染色（比例尺：20 μm）。(H) HepG2細(xì)胞中FerroOrange（亞鐵離子）染色（比例尺：20 μm）。(I) HepG2細(xì)胞中線粒體的代表性電鏡圖像（比例尺：500 nm）。(J) HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（Tfr1）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（Gpx4）、鐵死亡抑制蛋白1（Fsp1）、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶4（Acsl4）和前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（Ptgs2）的mRNA表達(dá)。(K) HepG2細(xì)胞中GPX4、FSP1、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TFR1）、ACSL4和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（FPN1）的蛋白水平。(L) 小鼠肝臟GPX4免疫熒光染色（比例尺：20 μm）。

4.天麻素在體外通過(guò)抑制鐵死亡緩解非酒精性脂肪肝病。

圖4. 天麻素（GAS）在體外通過(guò)抑制鐵死亡緩解非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。(A)HepG2細(xì)胞中丙二醛（MDA）水平。(B) HepG2細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）水平。(C) DHE（二氫乙啶）染色（比例尺：20 μm）。(D) FerroOrange（亞鐵離子）染色（比例尺：20 μm）。(E) BODIPY C11（脂質(zhì)過(guò)氧化）熒光染色（比例尺：20 μm）。(F) JC-1（線粒體膜電位）染色（比例尺：20 μm）。(G) GPX4（谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4）免疫熒光染色（比例尺：40 μm）。(H) HepG2細(xì)胞中油紅O染色（脂滴，比例尺：50 μm）。(I) SREBP1（固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1）、CPT1A（肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A）、ACOX1（酰基輔酶A氧化酶1）、PPAR-α（過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α）和FAS（脂肪酸合酶）的蛋白表達(dá)水平。(J) GPX4、FSP1（鐵死亡抑制蛋白1）、TFR1（轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1）、ACSL4（長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶4）和FPN1（膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1）的蛋白表達(dá)水平。

5.天麻素促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位并增強(qiáng)FSP1和GPX4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖5. 天麻素（GAS）促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位并增加FSP1和GPX4的轉(zhuǎn)錄。(A)小鼠肝臟中Nrf2（核因子E2相關(guān)因子2）和Keap1（Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1）的蛋白水平。(B) HepG2細(xì)胞中Nrf2和Keap1的蛋白水平。(C) 經(jīng)PA+OA（棕櫚酸+油酸）和/或GAS/SFN（蘿卜硫素）處理的HepG2細(xì)胞中胞漿與細(xì)胞核Nrf2蛋白水平。(D) Nrf2免疫熒光染色（比例尺：5 μm）。(E) HepG2細(xì)胞中Fsp1和Gpx4的mRNA表達(dá)。(F) Nrf2峰頂富集的基序。(G) AIFM2（凋亡誘導(dǎo)因子線粒體關(guān)聯(lián)蛋白2）啟動(dòng)子中ARE（抗氧化反應(yīng)元件）結(jié)合位點(diǎn)示意圖。(H) AIFM2啟動(dòng)子區(qū)域Nrf2結(jié)合峰的ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序）結(jié)果（數(shù)據(jù)來(lái)源：GSE91809）。(I) Fsp1和Gpx4啟動(dòng)子活性的熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。

6.天麻素通過(guò)Keap1/Nrf2信號(hào)通路保護(hù)HepG2細(xì)胞免受鐵死亡影響。

圖6. 天麻素（GAS）通過(guò)Keap1/Nrf2信號(hào)通路保護(hù)HepG2細(xì)胞免受鐵死亡影響。(A)丙二醛（MDA）水平。(B) 谷胱甘肽（GSH）水平。(C) DHE（二氫乙啶）染色（比例尺：20 μm）。(D) FerroOrange（亞鐵離子）染色（比例尺：20 μm）。(E) JC-1（線粒體膜電位）染色（比例尺：20 μm）。(F) BODIPY C11（脂質(zhì)過(guò)氧化）熒光染色（比例尺：10 μm）。(G) FSP1（鐵死亡抑制蛋白1）免疫熒光染色（比例尺：40 μm）。(H) SREBP1（固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1）、CPT1A（肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A）、ACOX1（酰基輔酶A氧化酶1）、PPAR-α（過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α）和FAS（脂肪酸合酶）的蛋白表達(dá)水平。(I) 油紅O染色（脂滴）（比例尺：50 μm）。(J) GPX4（谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4）、FSP1、TFR1（轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1）、ACSL4（長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶4）和PTGS2（前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2）的mRNA表達(dá)水平。(K) GPX4、FSP1、TFR1、ACSL4和FPN1（膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1）的蛋白表達(dá)水平。

7.天麻素直接靶向Keap1以降低其與Nrf2的結(jié)合。

圖7. 天麻素（GAS）直接靶向Keap1以減弱其與Nrf2的結(jié)合。(A)通過(guò)細(xì)胞熱位移分析檢測(cè)GAS處理下Keap1的熱穩(wěn)定性。(B) 在48°C下，不同濃度GAS對(duì)Keap1穩(wěn)定性的影響。(C) 在蛋白酶與蛋白比例為1:300的條件下，不同濃度GAS對(duì)Keap1穩(wěn)定性的影響。(D) GAS與Keap1的分子相互作用示意圖，結(jié)合能為-6.8 kcal/mol。(E) GAS處理后，通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)Nrf2與Keap1的結(jié)合情況。

8.本研究的作用機(jī)制圖。

【結(jié)論與討論】

總之，我們的研究結(jié)果表明，天麻素（GAS）能夠通過(guò)Keap1/Nrf2信號(hào)軸減輕高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）進(jìn)展。 機(jī)制研究表明，GAS靶向Keap1，減少其與Nrf2的結(jié)合，并促進(jìn)Nrf2的穩(wěn)定與核轉(zhuǎn)位。研究發(fā)現(xiàn)，GAS處理后，Nrf2與下游抗氧化基因的啟動(dòng)子結(jié)合，從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄并抑制鐵死亡。本研究首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)揭示，GAS通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2信號(hào)通路，改善了鐵死亡驅(qū)動(dòng)的NAFLD（圖8）。 我們的發(fā)現(xiàn)為探索NAFLD的治療確立了一種新的治療策略和理論基礎(chǔ)。

注：本文原創(chuàng)表明為原創(chuàng)編譯，非聲張版權(quán)，侵刪！

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