Cell Death Differ?|?靶向中性粒細(xì)胞代謝重編程：陳乃宏/張釗/楚世峰團(tuán)隊(duì)揭示中性粒細(xì)胞CKLF1-PKM2軸驅(qū)動(dòng)缺...

缺血性腦卒中發(fā)生后，外周免疫細(xì)胞會(huì)迅速進(jìn)入腦損傷區(qū)域并參與炎癥反應(yīng)。其中，中性粒細(xì)胞是最早被募集到缺血腦組織的外周免疫細(xì)胞之一。中性粒細(xì)胞在卒中超急性期可快速產(chǎn)生活性氧（ ROS ），進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷、血腦屏障破壞和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。然而，中性粒細(xì)胞在卒中早期為何會(huì)迅速發(fā)生 ROS 爆發(fā)，其背后的代謝調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

近日 ， 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所陳乃宏、張釗和楚世峰團(tuán)隊(duì)在Cell Death & Differentiation在線發(fā)表題為A neutrophil-intrinsic CKLF1–PKM2 axis drives glycolytic flux for de novo DAG synthesis and pro-inflammatory ROS production的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞內(nèi)CKLF1通過結(jié)合PKM2重塑糖酵解代謝，促進(jìn)DAG-ROS信號(hào)軸激活，從而驅(qū)動(dòng)卒中后中性粒細(xì)胞炎癥募集和腦損傷。

CKLF1 在卒中超急性期中性粒細(xì)胞中迅速上調(diào)

研究團(tuán)隊(duì)首先檢測了缺血性卒中患者外周血免疫細(xì)胞中 CKLF1 的表達(dá)。結(jié)果顯示，在卒中發(fā)生后 5–8 小時(shí) ，患者中性粒細(xì)胞中的 CKLF1 顯著升高，約為健康對照的 5 倍 ，而到 24 小時(shí)基本恢復(fù)至基線水平。相比之下，單核細(xì)胞中的 CKLF1 在早期并未明顯變化，而是在 24 小時(shí)后才出現(xiàn)升高。在小鼠腦缺血再灌注模型和光栓塞模型中，研究者也觀察到類似現(xiàn)象。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞 CKLF1 水平與 ROS 水平高度相關(guān)。 CKLF1 缺失顯著降低卒中后中性粒細(xì)胞 ROS 生成、 NETosis 以及 TNF-α 、 IL-1β 、 IL-6 等炎癥因子表達(dá)。這些結(jié)果提示， CKLF1 是卒中超急性期中性粒細(xì)胞 ROS 爆發(fā)和炎癥激活的重要調(diào)控因子。

CKLF1 驅(qū)動(dòng)中性粒細(xì)胞糖酵解重編程并促進(jìn) ROS 生成

為了探究 CKLF1 如何調(diào)控 ROS 生成，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了特異性 敲除中性粒細(xì)胞 Cklf1 小鼠，并對卒中后 6 小時(shí)外周中性粒細(xì)胞進(jìn)行了 轉(zhuǎn)錄組 和代謝功能分析。 RNA- seq 結(jié)果顯示， CKLF1 缺失后，中性粒細(xì)胞中顯著改變的通路主要富集于糖酵解 、 葡萄糖代謝 、 丙酮酸代謝 等通路。

利用 Seahorse 代謝分析實(shí)時(shí)監(jiān)測中性粒細(xì)胞的糖酵解通量和 ROS 產(chǎn)生。結(jié)果顯示，卒中后中性粒細(xì)胞糖酵解活性顯著增強(qiáng)，而 CKLF1 缺失明顯削弱糖酵解增強(qiáng)和 ROS 生成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， CKLF1 并不是簡單增加葡萄糖攝取，而是促進(jìn)糖酵解通量進(jìn)入 DAG 從頭合成途徑。 DAG 作為 PKC 內(nèi)源性激活分子，可促進(jìn) p47-phox 磷酸化，驅(qū)動(dòng) NADPH 氧化酶復(fù)合體組裝，從而誘導(dǎo) ROS 產(chǎn)生。

CKLF1 直接結(jié)合 PKM2 四 聚體并穩(wěn)定其糖酵解催化功能

PKM2 是糖酵解末端關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。 PKM2 不同構(gòu)象具有不同功能，其中四聚體形式主要負(fù)責(zé)糖酵解催化活性。研究團(tuán)隊(duì)通過 共免疫 沉淀、微量 熱泳動(dòng) 、分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法發(fā)現(xiàn)， CKLF1 可直接結(jié)合 PKM2 四 聚體，而并非主要結(jié)合 PKM2 單體或二聚體。該相互作用可穩(wěn)定 PKM2 四 聚體，增強(qiáng)其催化活性，從而維持高糖酵解通量。

在人源 HL-60 誘導(dǎo)分化的中性粒樣細(xì)胞模型中， CKLF1 敲除顯著降低 PKM2 四 聚體水平、 PK 活性、 DAG 生成、 p47-phox 磷酸化和 ROS 產(chǎn)生。重新表達(dá) CKLF1 或激活 PKM2 四 聚體可恢復(fù)上述表型，進(jìn)一步證明 CKLF1-PKM2 軸在中性粒細(xì)胞代謝炎癥激活中的因果作用。

CKLF1 促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附、募集并加重腦損傷

中性粒細(xì)胞 ROS 不僅會(huì)造成氧化損傷，還會(huì)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附。研究團(tuán)隊(duì)利用 微流控 系統(tǒng)模擬血流剪切環(huán)境，發(fā)現(xiàn)卒中后中性粒細(xì)胞黏附能力顯著增強(qiáng)，且黏附能力與細(xì)胞內(nèi) ROS 水平正相關(guān)。 CKLF1 缺失則顯著降低中性粒細(xì)胞 ROS 水平和黏附能力。進(jìn)一步通過 活體雙 光子成像動(dòng)態(tài)觀察腦缺血半暗帶血管中的中性粒細(xì)胞行為發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞特異性敲除 Cklf1 可顯著減少中性粒細(xì)胞的黏附、爬行和跨內(nèi)皮遷移。機(jī)制上， CKLF1 缺失降低中性粒細(xì)胞表面整合素 αMβ2 表達(dá)，并減少缺血半暗帶血管內(nèi)皮 ICAM1 表達(dá)，從而削弱中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮的相互作用。更重要的是，中性粒細(xì)胞特異性 Cklf1 敲除可顯著減小卒中后腦梗死體積、降低腦水腫，并改善運(yùn)動(dòng)、感覺和認(rèn)知功能恢復(fù)。該保護(hù)作用在雌雄小鼠中均存在，提示其具有較穩(wěn)定的治療潛力。

靶向 CKLF1-PKM2 相互作用的納米治療策略

基于上述機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開發(fā)了一種靶向中性粒細(xì)胞的納米治療策略 CKLF1 的多肽 C19 ，用于競爭性阻斷 CKLF1 與 PKM2 四 聚體的結(jié)合。為提高其穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)遞送效率，進(jìn)一步篩選獲得訂書 肽 形式 SP-C19-3 ，并利用工程化大腸桿菌外膜囊泡（ outer membrane vesicles, OMVs ）進(jìn)行遞送，構(gòu)建了 C19@OMVs 納米制劑。功能實(shí)驗(yàn)顯示， C19@OMVs 能夠有效打斷 CKLF1-PKM2 結(jié)合，降低 PKM2 四 聚 體水平 和 PK 活性，抑制 DAG 合成、 p47-phox 磷酸化和 NADPH 氧化酶活化，從而減少 ROS 產(chǎn)生。在卒中模型中， C19@OMVs 治療顯著減少中性粒細(xì)胞募集和 αMβ2 表達(dá)，降低腦梗死損傷，并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

該研究揭示了 CKLF1 不僅是傳統(tǒng)意義上的趨化因子，也可作為中性粒細(xì)胞內(nèi)源性代謝調(diào)控因子，直接參與糖酵解重編程 ， 并且 證明 CKLF1-PKM2 蛋白相互作用是抑制中性粒細(xì)胞病理性激活的潛在干預(yù)靶點(diǎn) ， 提出利用工程化 OMVs 遞送訂書肽、靶向中性粒細(xì)胞胞內(nèi)蛋白互作的新型治療策略，為卒中及其他中性粒細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的炎癥疾病提供了新的干預(yù)思路。

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 阮元與范平龍博士為論文共同第一作者，楚世峰，張釗，陳乃宏 研究員 為共同通訊作者 。

原文鏈接： https://www.nature.com/articles/s41418-026-01754-1

制版人：十一

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