上海中醫藥大學附屬曙光醫院團隊《民族藥理學》揭示扶正化瘀方可通過抑制Gli1通路減輕導管反應和肝纖維化

【寫在前面】：本期推薦的是由上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所、上海中醫藥大學附屬曙光醫院中西醫結合外科研究所等研究團隊合作近期發表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示扶正化瘀方可能通過抑制Gli1通路減輕導管反應和肝纖維化。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Fuzheng Huayu formula attenuates ductular reaction and liver fibrosis potentially through suppressing Gli1 pathway

民族藥理學相關性

扶正化瘀方（FZHY）臨床上用于治療肝纖維化，但其藥理機制尚不完全清楚。

目的

探討扶正化瘀方的抗纖維化作用，尤其是對膽汁淤積性肝纖維化的療效，以及其潛在的分子機制。

方法

采用Mdr2基因敲除小鼠和CCl?/2-AAF誘導的肝纖維化模型大鼠評估扶正化瘀方的治療潛力，并以Gli1抑制劑GANT61作為陽性對照藥物。通過組織學分析和雙免疫熒光技術檢測扶正化瘀方對導管反應和肝纖維化的影響。體外實驗中，使用肝祖細胞系WB-F344細胞，轉導過表達Gli1的慢病毒載體，并用丁酸鈉誘導分化，以驗證扶正化瘀方的作用機制。

結果

在Mdr2小鼠和CCl?/2-AAF誘導的大鼠模型中，扶正化瘀方能明顯改善肝纖維化，表現為膠原沉積減少、肝臟羥脯氨酸含量降低以及炎性細胞浸潤減輕。扶正化瘀方降低了Epcam、CK19和CK7的表達。雙免疫熒光顯示，CCl?/2-AAF大鼠中CK19?和OV6?細胞數量增多，而扶正化瘀方治療后減少。機制上，扶正化瘀方下調了肝臟中Gli1的表達。值得注意的是，在CCl?/2-AAF誘導的大鼠中，扶正化瘀方對導管反應和肝纖維化的抑制作用與Gli1抑制劑GANT61相似。體外實驗中，扶正化瘀方對WB-F344細胞向膽管表型分化的抑制作用也與GANT61相似。此外，過表達Gli1的慢病毒轉染實驗證實，扶正化瘀方以Gli1依賴性方式抑制WB-F344細胞向導管表型分化。

結論
扶正化瘀方具有顯著的抗纖維化作用，其機制可能通過抑制Gli1通路，從而抑制肝祖細胞向導管表型分化。這一發現為扶正化瘀方的作用機制提供了新的見解，并提示Gli1信號通路可能在其抗纖維化作用中發揮重要作用。

圖文摘要

【前言】

肝纖維化是一種以細胞外基質過度積聚和纖維瘢痕形成為特征的進行性病理狀態，常繼發于病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病和自身免疫性肝炎等慢性肝病，構成重大的全球性健康挑戰。若不及時干預，肝纖維化最終會進展為肝硬化和肝細胞癌。肝纖維化的程度與多種肝臟疾病的死亡率直接相關。流行病學證據表明，肝硬化占全球年死亡率的2.4%，其中中國占全球肝硬化相關死亡病例的14.9%。由于如此沉重的疾病負擔，肝纖維化的臨床治療仍然是一項艱巨的任務。值得注意的是，臨床前研究和動物模型已經證實，纖維化病變具有潛在的可逆性，即使在早期肝硬化階段也是如此。這些發現為制定針對性的治療策略奠定了堅實的科學基礎。然而，盡管研究力度很大，迄今尚無抗纖維化藥物獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）的批準，這凸顯了有效治療干預措施的迫切需求。

導管反應是一種見于多種肝臟疾病的組織學特征，表現為反應性導管細胞的增生，同時伴有炎性細胞浸潤、匯管區水腫和纖維化。由于損傷刺激的多樣性，導管反應中導管細胞的來源可以是肝祖細胞（HPC）、膽管細胞或肝細胞。在我們既往的工作中，發現原發性膽汁性膽管炎（PBC）、乙型肝炎病毒（HBV）感染和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者中CK19?導管細胞的積聚與膠原面積和α-SMA面積均呈正相關。同時，我們的研究證明，來源于HPC的導管反應在多種嚙齒動物模型中顯著促進肝纖維化的進展，包括四氯化碳（CCl?）聯合2-乙酰氨基芴（2-AAF）誘導的大鼠、膽管結扎誘導的大鼠、多藥耐藥基因2敲除小鼠（Mdr2?/?小鼠）以及CCl?聯合西方飲食誘導的小鼠。導管反應細胞傾向于分泌一系列促炎和促纖維化細胞因子，如轉化生長因子β1（TGFβ1）、TGFβ2、白細胞介素-6、血小板源性生長因子和趨化因子2。這些細胞因子的分泌促進匯管區成纖維細胞和肝星狀細胞（HSC）的活化，導致巨噬細胞和中性粒細胞的積聚，從而啟動或促進肝纖維化過程。

神經膠質瘤相關癌基因同源物（Gli）家族是最早發現與人類疾病相關的發育調控基因之一，是經典和非經典Hedgehog（Hh）信號通路的末端效應轉錄因子，包括Gli1、Gli2和Gli3。其中，Gli1具有五個保守的鋅指DNA結合結構域，使其能夠與其靶基因的啟動子區域相互作用。Gli1的異常激活與細胞增殖和分化過程的失調密切相關。值得注意的是，這種異常激活與器官纖維化的發生和進展密切相關。我們前期的研究證實，在肝纖維化進展過程中，Gli1在促進來源于HPC的導管反應中發揮關鍵作用。在刺激多能干細胞分化為導管表型的模型中，已發現細胞角蛋白19（CK19）和CK7的啟動子區域包含Gli1的特異性結合序列，表明它們是Gli1促進導管細胞增殖的直接靶點。基于這些發現，阻斷HPC來源的導管反應中Gli1的激活，成為極具前景的抗肝纖維化治療方向。

中醫藥在中國治療肝纖維化有著悠久的歷史。根據中醫理論，肝纖維化的病機常以“正氣虧虛、瘀血內阻”為特征。因此，治療原則強調扶助正氣、活血化瘀，這一策略與扶正化瘀方（FZHY）的組方思路高度一致。扶正化瘀方由丹參（8克）、蟲草（4克）、桃仁（2克）、絞股藍（6克）、五味子（2克）和松花粉（2克）組成。由于該方在肝纖維化和肝硬化患者中具有顯著的臨床療效，已獲得中國國家食品藥品監督管理局批準（批準文號：Z20050546）。此外，其療效已在美國FDA針對慢性丙型肝炎患者的Ⅱ期臨床試驗中得到進一步驗證。然而，扶正化瘀方作用于肝祖細胞的具體機制尚不清楚，急需闡明。

本研究旨在兩種體內模型（CCl?聯合2-AAF誘導的大鼠和Mdr2?/?小鼠）以及丁酸鈉（SB）誘導HPC分化的體外模型中，探討扶正化瘀方的藥理作用。我們的研究結果有力地證明，扶正化瘀方可能通過抑制Gli1通路，從而抑制HPC向導管表型分化，進而減輕肝纖維化。

【結果部分】

1. 扶正化瘀方改善Mdr2?/?小鼠的膽汁淤積性肝纖維化。

圖 2. 扶正化瘀方改善 Mdr2?/? 小鼠的膽汁淤積性肝纖維化。A. 肝臟連續切片代表性圖像：H&E 染色（200×）、天狼星紅染色（100×）、α-SMA 和 F4/80 免疫組織化學染色（200×）。B. 血清 ALT 含量（n = 6）。C. 血清 AST 含量（n = 6）。D. 天狼星紅陽性面積百分比形態計量學分析（n = 6）。E. 羥脯氨酸含量（n = 6）。F. Acta2 和 Col-I 的 mRNA 表達（n = 6）。G. α-SMA 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。與野生型對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 Mdr2?/? 組相比， < 0.05，# < 0.01。WT：野生型組；Mdr2?/?：Mdr2 基因敲除組；FZHY：扶正化瘀方治療組；OCA：奧貝膽酸治療組

2. 扶正化瘀方減輕CCl?聯合2-AAF誘導的大鼠肝纖維化。

圖 3. 扶正化瘀方減輕 CCl? 聯合 2-AAF 誘導的大鼠肝纖維化。A. 肝臟連續切片代表性圖像：H&E 染色（200×）、天狼星紅染色（100×）、以及 Col-Ⅰ 和 α-SMA 免疫組織化學染色（200×）。B. 血清 ALT 含量（n = 5）。C. 血清 AST 含量（n = 5）。D. 天狼星紅陽性面積百分比形態計量學分析（n = 5）。E ～ G. Acta2、Col-I、Col-III 和 Col-IV 的相對 mRNA 表達量（n = 5）。H. α-SMA 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。與對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 CCl?/2-AAF 組相比， < 0.05，##P < 0.01。Oil：對照組；CCl?/2-AAF：四氯化碳聯合 2-乙酰氨基芴處理組；FZHY：扶正化瘀方治療組；GANT61：GANT61 治療組。

3. 扶正化瘀方抑制纖維化環境中的導管反應。

圖 4. 扶正化瘀方抑制 Mdr2?/? 小鼠中的導管反應。A. Epcam、CK7 和 CK19 免疫組織化學染色代表性圖像（200×）。B. Krt19、Epcam 和 Krt7 的相對 mRNA 表達量（n = 6）。C. CK19 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。與野生型對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 Mdr2?/? 組相比， < 0.05，# < 0.01。WT：野生型組；Mdr2?/?：Mdr2 基因敲除組；FZHY：扶正化瘀方治療組；OCA：奧貝膽酸治療組。

圖 5. 扶正化瘀方抑制 CCl?/2-AAF 誘導的大鼠中的導管反應。A. OV6、Epcam、CK19 和 CK7 免疫組織化學染色代表性圖像（200×）。B. CK19（紅色）與 OV6（綠色）共染色的共聚焦分析（200×）。C. Krt19、Epcam 和 Krt7 的相對 mRNA 表達量（n = 5）。D. CK19 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。與對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 CCl?/2-AAF 組相比， < 0.05，# < 0.01。Oil：對照組；CCl?/2-AAF：四氯化碳聯合 2-乙酰氨基芴處理組；FZHY：扶正化瘀方治療組；GANT61：GANT61 治療組。

4. 扶正化瘀方在纖維化模型中抑制Hedgehog信號通路。

圖 6. 扶正化瘀方減輕纖維化動物模型中 Hedgehog 通路的激活。A. Mdr2?/? 小鼠中 Dhh、Shh、Ihh、Smo、Ptch1、Ptch2、Gli1 和 Gli2 的 mRNA 表達量（n = 6）。B. Gli1 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。C. CCl?/2-AAF 誘導的大鼠中 Dhh、Ihh、Shh、Ptch1、Ptch2、Smo、Gli1、Gli2 和 Gli3 的相對 mRNA 表達量（n = 5）。與對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 CCl?/2-AAF 組或 Mdr2?/? 組相比， < 0.05，# < 0.01。WT：野生型組；Mdr2?/?：Mdr2 基因敲除組；FZHY：扶正化瘀方治療組；OCA：奧貝膽酸治療組。Oil：對照組；CCl?/2-AAF：四氯化碳聯合 2-乙酰氨基芴處理組；FZHY：扶正化瘀方治療組；GANT61：GANT61 治療組。

5.扶正化瘀方在體外抑制了肝祖細胞向膽管細胞的分化及扶正化瘀方以Gli1依賴的方式減輕了導管反應。

圖 7. 扶正化瘀方在體外抑制肝祖細胞向膽管細胞的分化。A. 扶正化瘀方對 WB-F344 細胞的細胞活力影響。B. Krt19 和 Krt7 的 mRNA 表達量（n = 3）。C. CK19 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。D. Dhh、Smo、Ptch2、Gli1 和 Gli2 的 mRNA 表達量（n = 3）。E. Krt19、Krt7 和 Gli1 的 mRNA 表達量（n = 3）。F. WB-F344 細胞經 CK19 染色的代表性熒光圖像（600×）。G. CK19 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。H. Krt19 和 Gli1 的 mRNA 表達量（n = 3）。與對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 SB 誘導模型組相比， < 0.05，# < 0.01；與扶正化瘀方低劑量組相比，△P < 0.05，△△P < 0.01。a：與 OE-Neg 組相比，P < 0.05；b：與 OE-Gli1 組相比，P < 0.05；c：與 SB + OE-Gli1 組相比，P < 0.05；d：與 SB + OE-Neg 組相比，P < 0.05。

【結論與討論】

總之，我們最近的研究提供了進一步的證據，支持扶正化瘀方（FZHY）對肝纖維化（包括膽汁性纖維化）的治療效果。我們的研究首次表明，扶正化瘀方的抗纖維化機制涉及抑制肝祖細胞（HPC）向導管表型分化，且這一作用似乎與抑制Gli1信號通路相關。

注：本文原創表明為原創編譯，非聲張版權，侵刪！

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