HR+BC的基因融合圖譜揭示了ADK融合基因作為癌癥進展和潛在治療靶點的驅動因素

引言

基因融合是由基因組易位、插入、缺失或染色體倒位引起的分子畸變，相當一部分基因融合會驅動腫瘤發生發展。近年來針對基因融合產生的致癌激酶的靶向療法在多種癌癥中展現出了良好療效。然而，它們在乳腺癌（BC）中的作用及臨床意義仍未被深入探索。一項發表于Cell Discovery（IF=12.5）的研究利用大規模多組學隊列和藥物篩選平臺，系統分析了BC中的融合基因，并重點探究了ADK融合基因在激素受體陽性/人表皮生長因子受體2陰性（HR+/HER2-）BC中的作用，為HR+/HER2- BC的精準治療提供參考。據此，本文特將相關內容整理如下，以饗讀者。

研究背景

在BC中，基因融合很常見，然而具有病理學意義的融合基因仍然非常罕見。這可歸因于幾個因素：首先，區分真實融合事件與假陽性的技術挑戰，阻礙了大規模基因融合的發現。其次，單個融合事件的低發生頻率降低了研究人員探索這些基因功能的興趣。因此，大多數研究側重于通過脫氧核糖核苷酸（DNA）或核糖核酸（RNA）測序識別融合基因，而不重視驗證其致癌潛力或在調節治療反應中的作用。此外，大多數研究受限于小樣本量和單一組學維度，限制了對BC中融合基因圖譜及其對疾病進展影響的全面理解。本研究旨在通過利用大規模多組學隊列和藥物篩選平臺，系統地描繪BC中的融合基因圖譜。

研究方法

本研究為系統探索BC中融合基因的生物學和臨床相關性，建立了大規模多組學隊列（FUSCC-BRCA，包含1226名中國BC患者的多組學數據，來自上海復旦大學附屬腫瘤醫院）和用于藥物敏感性測試的患者來源類器官隊列（FUSCC-PDOs，包含192例樣本）。此外，研究還納入了癌癥基因組圖譜隊列（TCGA-BRCA，包含來自TCGA的983名患者的多組學數據），以支持外部驗證和生物學表征描述。所有組織樣本均在復旦大學上海癌癥中心倫理委員會批準后獲取，并獲得每位患者的書面知情同意。PDOs的培養遵循已發表的方案，所有臨床樣本均獲得患者知情同意并經FUSCC倫理委員會批準。

研究方法包括：細胞增殖和克隆形成實驗、劃痕愈合和細胞遷移/侵襲實驗、免疫印跡分析。在體外，通過慢病毒載體將KAT6B::ADK、截短的KAT6B（ΔKAT6B）或野生型ADK的全長開放閱讀框引入融合陰性乳腺上皮細胞系MCF7和T47D中以進行異位表達。使用6周齡NOD/SCID雌性小鼠進行實驗，在細胞注射前一天，將17β-雌二醇釋放顆粒植入肩胛間皮下區域，將MCF7細胞原位注射到第四腹部脂肪墊中，待腫瘤形成可觸及腫塊后開始治療。小鼠被隨機分配到對照組（用DMSO處理）或他莫昔芬治療組（45 mg/kg/d，口服灌胃）。將狀態良好的PDOs稀釋并接種到384孔板中，培養3天后再進行藥物處理。使用CellTiter-Glo 3D細胞活力檢測試劑盒評估藥物處理5天后的類器官細胞活力。

研究的主要目標是識別新的融合基因，描述其分子生物學特征，探討其在BC進展中的生物學功能，進行藥物敏感性分析，并提出靶向治療策略。次要目標是探索融合基因與總生存期（OS）、無復發生存期（RFS）和無遠處轉移生存期（DMFS）的關聯，以及評估細胞遷移、侵襲、增殖能力、他莫昔芬耐藥情況、三磷酸腺苷和腺苷（ADK代謝底物）水平、整合應激反應（ISR）通路激活以及液-液相分離（LLPS）特征。

研究結果

研究通過對RNA測序數據中融合基因的生物信息學分析，共鑒定出6156個融合基因。其中，絕大多數是獨特融合，僅在所有樣本中出現一次（5678/6156，92.24%），復發融合（出現兩次或更多次）占比相對較小（478/6156，7.76%）。研究發現，絕大多數BC組織（925/1110，83.33%）含有融合基因，而癌旁組織中僅有少數（29/148，19.6%）含有融合基因。在BC中，激素受體陰性（HR-）/HER2+亞型中融合基因的頻率最高。研究進一步探索了融合基因與不同亞型預后的關系，發現融合基因僅與HR+/HER2-亞型患者的較短OS、RFS和DMFS相關，而在其他亞型中未觀察到此類關聯。

在HR+/HER2- BC中，融合基因與更高頻率的抑癌基因TP53突變顯著相關，融合基因陽性腫瘤中突變率為29.6%，融合基因陰性腫瘤中突變率為11.3%（P<0.001）。研究還觀察到融合基因的存在與更高的腫瘤突變負荷（TMB）、升高的Ki67指數、更高的同源重組缺陷（HRD）評分相關。基因集富集分析（GSEA）顯示，在攜帶融合基因的腫瘤樣本中，DNA損傷修復、細胞周期調控和炎癥反應相關的HALLMARK基因集顯著富集。

激酶融合基因占所有融合基因陽性患者的12.5%，其中25.4%的激酶融合基因可被現有藥物靶向。激酶融合陽性患者的他莫昔芬耐藥評分降低，而阿那曲唑耐藥評分升高。激酶融合陽性腫瘤具有更高的Ki67增殖指數和更高的淋巴結轉移率，提示與腫瘤的侵襲性相關。

預后分析顯示，激酶融合陽性僅與HR+/HER2- BC的不良預后相關，在其他亞型中未觀察到顯著的預后影響。ADK融合基因在FUSCC-BRCA隊列和TCGA-BRCA隊列中均高發。攜帶ADK融合基因的患者預后更差，且ADK融合腫瘤往往更大。在FUSCC-BRCA隊列中，KAT6B::ADK融合基因的檢測頻率為0.4%(2/563)，在PDOs隊列中為2.6%(5/192)。桑格測序證實了所有5例PDOs病例和FUSCC-BRCA患者中KAT6B::ADK斷點的一致性。

為闡明KAT6B::ADK在HR+/HER2- BC進展中的生物學機制，研究首先在融合基因陰性乳腺上皮細胞系MCF7和T47D中引入了KAT6B::ADK的全長開放閱讀框。結果顯示，KAT6B::ADK異位表達細胞與ADK異位表達細胞相比，其遷移和侵襲能力顯著增強。進一步的體內研究使用原位異種移植模型證實了KAT6B::ADK的促轉移作用，其促進MCF7細胞向肺、腦、肝和骨等遠處器官轉移。

細胞增殖活性評估顯示，KAT6B::ADK僅輕度增加了HR+/HER2- BC細胞的增殖活性。在NIH-3T3細胞中異位表達KAT6B::ADK顯著促進了體外增殖，并在免疫缺陷小鼠中誘導了腫瘤發生。將KAT6B::ADK引入MCF10A細胞，破壞了三維基底膜培養中的腺泡形態，導致填充性腺泡結構減少，出現大的無序結構。

他莫昔芬敏感性實驗顯示，KAT6B::ADK過表達的MCF7和T47D細胞，他莫昔芬半數抑制濃度（IC50）增加，表明KAT6B::ADK促進了他莫昔芬耐藥。體內小鼠模型也觀察到一致的結果，KAT6B::ADK過表達的腫瘤對他莫昔芬治療反應最小，而對照組腫瘤受到顯著抑制。

研究假設KAT6B::ADK可能激活ADK激酶活性。結果顯示，過表達KAT6B::ADK的細胞中ATP生成和釋放水平升高，細胞內腺苷水平降低，表明ADK激酶活性的組成性活性被激活。與單獨ADK相比，KAT6B::ADK誘導了更高水平的ATP生成和釋放，這表明發生基因融合增強了ADK的活性。

研究發現KAT6B::ADK融合蛋白在細胞質中呈離散點狀分布，形成生物分子凝聚體。活細胞成像和光脫色熒光恢復技術（FRAP）實驗證實了這些凝聚體具有動態性和液態特征，屬于生物分子凝聚體。用1,6-己二醇處理，可有效溶解這些凝聚體，進一步證明了其LLPS的性質。研究生成了KAT6B::ADK融合蛋白中無序結構域1（IDR1）、IDR2和IDR3區域的缺失變體，發現缺失IDR1導致凝聚體數量和大小減少，而敲除IDR2或IDR3則導致彌散性分布。這些缺失IDR的KAT6B::ADK突變體在ADK通路中的代謝變化顯示，ATP生成和釋放減少，腺苷水平升高。重要的是，這些突變體恢復了他莫昔芬敏感性，并顯著損傷了細胞遷移。

KAT6B::ADK過表達導致ISR通路顯著上調，激活轉錄因子3（ATF3）、ATF4、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）和磷酸化GCN2（p-GCN2）水平升高，以及ATF3和ATF4 mRNA表達升高。ATF4敲低或GCN2抑制可逆轉他莫昔芬耐藥，證實ISR通路是KAT6B::ADK與治療耐藥之間具有聯系。ADK特異性抑制劑ABT-702處理可有效消除KAT6B::ADK介導的這些因子上調，表明ISR通路激活依賴于ADK激酶活性。

在攜帶內源性KAT6B::ADK融合基因的PDOs中，靶向KAT6B::ADK連接點的短發夾RNA（shRNA）策略實現了融合轉錄本的有效敲低。敲低誘導了顯著的代謝變化，包括細胞內ATP水平降低和腺苷濃度增加，這與ADK激酶活性降低一致。分子分析顯示，KAT6B::ADK敲低和ADK的藥物抑制（使用ABT-702）均減弱了ISR通路的激活，表明KAT6B::ADK融合蛋白及其激酶活性對ISR誘導至關重要。此外，KAT6B::ADK敲低恢復了PDOs對他莫昔芬的敏感性。

PDOs中融合連接點的桑格測序證實斷點與FUSCC-BRCA隊列中的斷點一致。重要的是，攜帶KAT6B::ADK的PDOs對ADK抑制劑的敏感性增加，表現為利巴韋林處理后細胞活力顯著降低。這些PDOs也表現出他莫昔芬耐藥的特征。

系統性分類的ADK融合變體顯示出結構依賴的功能特性。框內ADK::LRMDA融合基因表現出最強的致癌潛力，具有強大的細胞質凝聚體形成能力（通過LLPS）、增強的激酶活性、對細胞遷移的強烈誘導作用，以及對內分泌治療的耐藥。相比之下，框外ADK::PCDH15變體通過N末端定位保留了催化活性，盡管PCDH15截斷，但仍保留ADK閱讀框，表現為彌散定位而無凝聚體，并維持與野生型ADK相當的激酶活性水平。

功能性實驗結果顯示，ADK::PCDH15顯著增加了他莫昔芬耐藥和細胞遷移能力，但作用弱于ADK::LRMDA。相反，C末端LRMDA::ADK因移碼導致ADK閱讀框缺失，激酶活性可忽略不計，對內分泌治療耐藥或細胞遷移無顯著影響。這些分析揭示了功能性ADK融合的兩個關鍵要求：(1)保留激酶結構域；(2)通過IDR介導的LLPS誘導強大的激酶超活化（如ADK::LRMDA和KAT6B::ADK），或維持酶活性（如ADK::PCDH15）。

討論與結論

本研究利用大規模多組學隊列和藥物篩選平臺，全面探索了BC中的融合基因類型，并闡明了其臨床意義。研究通過整合生物信息學分析和功能驗證，識別出新型KAT6B::ADK融合基因可促進BC轉移和內分泌治療耐藥。研究結果表明，KAT6B::ADK通過LLPS誘導具有組成性活性的激酶激活，并具有可被利巴韋林治療抑制的轉化潛力。功能性ADK融合需要滿足兩個關鍵條件：1)保留激酶結構域；2)通過IDR介導的LLPS誘導強大的激酶超活化，或維持酶活性。

本研究也存在一定的局限性。ADK融合基因在研究隊列中的患病率相對較低，可能會限制研究結果的普遍性。未來需要更大規模、更多樣化的患者隊列來驗證ADK融合基因和其他功能性激酶融合基因作為生物標志物和治療靶點的臨床效用。此外，其他ADK融合變體的功能意義需要進一步研究，以全面闡明ADK驅動的腫瘤發生譜。最后，需要大規模前瞻性臨床研究來驗證和擴展研究結果，確立攜帶ADK融合基因患者的新型治療方案。

總之，本研究確定了ADK融合基因是HR+/HER2- BC中的致癌驅動基因，并表明融合蛋白可進行靶向治療。這些發現提出了ADK融合基因作為HR+/HER2- BC治療靶點的可能性，為該患者群體的創新精準治療策略提供了新途徑。

參考文獻：

1.Ou-Yang Y, et al. Landscape of gene fusions in hormone receptor-positive breast cancer reveals ADK fusions as drivers of progression and potential therapeutic targets. Cell Discov. 2025 Nov 11;11(1):89.

審批編號：CN-183333

有效期至：2027-04-27

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撰寫：Carp

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