網(wǎng)藥分析流程及進一步的機制驗證該如何做？

【網(wǎng)藥標準分析流程】

1 數(shù)據(jù)收集與處理

這是整個研究的基石，目標是分別獲取藥物的活性成分靶點和疾病的相關(guān)靶點。

①中藥活性成分篩選

主要數(shù)據(jù)庫：首選?TCMSP?（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫），也可以結(jié)合?TCMID?、BATMAN-TCM?、HERB?等數(shù)據(jù)庫進行補充，以確保成分的全面性。

篩選標準：通常采用口服生物利用度（OB）≥ 30% 和類藥性（DL）≥ 0.18作為初步篩選標準。

實操技巧：在TCMSP中篩選出成分后，需要去?PubChem?數(shù)據(jù)庫搜索每個成分的分子式或名稱，獲取其?SMILES?（化學(xué)結(jié)構(gòu)信息），這是后續(xù)靶點預(yù)測的關(guān)鍵。

②藥物靶點預(yù)測

預(yù)測工具：將上一步獲取的SMILES信息輸入到靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫中，常用的是?SwissTargetPrediction?，它對小分子化合物的靶點預(yù)測很準。也可以結(jié)合?PharmMapper?、STITCH?等工具進行交叉驗證。

數(shù)據(jù)整理：不同數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果可能有差異，建議取多個數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果的交集，以提高靶點的可靠性。預(yù)測后得到的靶點名稱需要統(tǒng)一，可以使用?UniProt?數(shù)據(jù)庫將蛋白名標準化為基因名。

③疾病相關(guān)靶點獲取

主要數(shù)據(jù)庫：在?GeneCards?、OMIM?、DisGeNET?等數(shù)據(jù)庫中搜索目標疾病，獲取與該疾病相關(guān)的基因靶點。

實操技巧：為了盡可能全面地獲取疾病靶點，建議同時使用多個數(shù)據(jù)庫檢索，然后合并結(jié)果。

2核心靶點篩選與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
這一步是將藥物靶點和疾病靶點進行匹配，并構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)來篩選核心靶點。

①獲取交集靶點

將藥物活性成分的靶點與疾病相關(guān)靶點取交集，得到的基因就是藥物干預(yù)該疾病的潛在核心靶點。可以使用在線工具如jvenn來繪制?韋恩圖?，直觀展示交集情況。

②構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

在 Cytoscape 中構(gòu)建藥物-活性成分-靶基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

③網(wǎng)絡(luò)可視化

將交集靶點導(dǎo)入?STRING數(shù)據(jù)庫?，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置置信度（confidence score）中等，然后導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)（通常是tsv格式）。將STRING導(dǎo)出的數(shù)據(jù)導(dǎo)入?Cytoscape?軟件進行可視化。

④篩選核心靶點

PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件使其可視化，然后利用CytoNCA插件分析初步的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)：Degree、緊密度(Closeness centrality，CC)和介度(Betweenness centrality，BC) 3個參數(shù)值。其中“度值”（Degree）是最重要的指標之一，代表一個節(jié)點（靶點）與其他節(jié)點的連接數(shù)。度值越高的靶點，在網(wǎng)絡(luò)中越核心，通常作為后續(xù)研究的關(guān)鍵基因。

3富集分析與機制預(yù)測

使用DAVID、Metascape或基迪奧等工具對核心靶點進行?GO?（基因本體論）和?KEGG?（通路）富集分析。GO的功能富集(包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC))和KEGG途徑的富集。檢索結(jié)果的過濾閾值為p<0.05，計數(shù)按降序排列。

10.結(jié)果分析

根 據(jù) K EGG 分析 結(jié)果， 篩 選 出 p <0. 05 的顯著通路，并結(jié)合“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖來系統(tǒng)性地闡述藥物的作 用機制 。 單個信號通路或者多個信號通路聯(lián)合分析驗證。

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